扩增曲线的阈值设置存在哪些常见错误？扩增曲线的阈值设置存在哪些常见错误

作者：admin 时间：2023-10-10 11:01:05 阅读数：15人阅读

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1、探讨新型冠状病毒核酸检测出现高循环阈值（Ct值）情况的原因（错误原因）。

2、CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。

3、以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

4、数据分析基线数据分析基线数据分析基线数据分析基线数据分析阈值线数据分析阈值线常见问题分析PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。

扩增曲线的阈值设置存在哪些常见错误？扩增曲线的阈值设置存在哪些常见错误

1、因为pcr利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。DNA模板纯度不纯的时候，会对PCR起抑制作用。PCR反应中，模板只要1ng就可以，所以模板浓度不要太高。直到掺入一种链终止核苷酸为止。

2、按你给的线索，菌落很少，很有可能是切开的线性质粒没有连上片段，转不进细胞，少量没有切开的空载体转进细胞，形成阴性菌落。

3、没有正确地设置基线和阈值线为了得到精确的Ct值，应当在丰度最高的样品所对应Ct值两个循环之前设置基线。为了使实时荧光定量PCR的数据有意义，应当在指数扩增期设置阈值线。

荧光定量PCR原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

基本原理 qPCR技术基于PCR技术，但是在PCR的基础上加入了荧光染料和检测系统。PCR是一种体外扩增DNA的技术，它通过反复复制DNA模板，使其数量呈指数级增长。

荧光定量pcr原理如下：荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。

高质量cDNA应具备以下几个特点：无基因组DNA残留、能准确反应出样本真实的转录情况和信息完整且浓度适当等特点。

用荧光定量pcr的方法来判断。定量pcr最好每个样本有三个重复，每次试验做三遍比较可靠。因为比较灵敏，有微小差异会影响很大。并且记得检查每个孔是否有误差很大的数值。同时还要设立内参，以确定样品结果的可信性。

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如果有标准曲线，按照标准曲线计算。一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。举例如下：对照组基因A的CT值为20，内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。

实时萤光定量PCR分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。常见荧光定量PCR困难包括引物、探针、反应抑制和软件分析等几个方面，本篇主要为大家分享引物和探针方面的经验。

实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR，属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。